Comment réaliser des boîtes de Pétri pour la culture mycologique : Gui

La culture de champignons et la mycologie, l'étude des champignons, sont des domaines fascinants qui attirent de plus en plus d'adeptes, amateurs comme professionnels.

Pour ceux qui souhaitent s'initier à la culture de champignons en laboratoire ou à domicile, l'utilisation de boîtes de Pétri est un point de départ incontournable.

Ce guide pratique vous explique pourquoi utiliser des boîtes de Pétri, comment choisir le bon milieu de culture, et vous présente une méthode simple pour préparer et couler des géloses en vue de vos expériences de mycologie.

Pourquoi utiliser des boîtes de Pétri en mycologie ?

Les boîtes de Pétri sont des récipients plats et transparents, généralement en plastique ou en verre, utilisés principalement pour cultiver des micro-organismes sur une gélose nutritive.

En mycologie, elles permettent de créer un environnement contrôlé pour observer et étudier la croissance des champignons, que ce soit pour la recherche, la clonage, la sélection de souches ou simplement l'apprentissage. Les boîtes de Pétri offrent plusieurs avantages :

1. Contrôle des conditions de culture : Elles permettent de manipuler les paramètres tels que le type de milieu, la température, l'humidité, et l'exposition à la lumière.
2. Observation aisée : Le couvercle transparent facilite l’observation directe du développement des mycéliums sans ouvrir la boîte, minimisant ainsi les risques de contamination.
3. Facilité d’isolement et de sélection : Les boîtes de Pétri permettent d’isoler des souches spécifiques ou de sélectionner des mycéliums sains pour de futures cultures.

Les différents milieux de culture pour les boîtes de Pétri et leur utilité

Le choix du milieu de culture est crucial en mycologie, car il affecte directement la croissance et la santé des champignons. Les milieux de culture se présentent sous forme de poudres à mélanger avec de l'eau et sont enrichis de divers nutriments pour favoriser la croissance des champignons. Voici les principaux types de milieux de culture et leurs utilisations :

1. Milieu "MEA+" (Malt Extract Agar + Peptone)

   Milieu nutritif riche, adapté à la culture de la majorité des mycéliums. Il favorise également le développement des bactéries, ce qui en fait un bon choix pour tester la pureté de l’air ou des échantillons (tests de contamination).

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   Milieu "Sabouraud + Antibiotique"

   Enrichi d’un antibiotique (généralement du chloramphénicol), ce milieu limite la croissance bactérienne et devient très sélectif. Il est idéal pour des manipulations sensibles comme le clonage de champignons sauvages ou la germination de spores, surtout en conditions non stériles. La croissance mycélienne peut toutefois y être un peu plus lente qu’avec un milieu comme MEA+.

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   Milieu "Water Agar" (WA)

   Agar pur sans nutriments ajoutés. Utilisé pour :

   • la purification de souches à partir de tissus contaminés,

   • la sélection naturelle (seuls les champignons survivent),

   • des observations spécifiques (morphologie, tests de croissance lente). C’est un support neutre, utile comme étape transitoire.

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   Milieu "PDA" (Potato Dextrose Agar)

   Préparé à partir d’extrait de pomme de terre et de glucose, c’est un milieu classique et universel en mycologie. Il stimule la croissance du mycélium et permet une bonne observation.
   Utilisé pour :

   • la culture générale du mycélium,

   • la conservation de souches,

   • la production de biomasse.
     Il est cependant sensible aux contaminations en raison de sa richesse en sucres.

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   Milieu "MYA" (Malt Yeast Agar)

   Contient de l’extrait de malt et de la levure. Il est particulièrement adapté à :

   • la germination de spores,

   • les espèces exigeantes (comme Hericium erinaceus ou certaines espèces forestières),

   • les conditions où une croissance vigoureuse est recherchée.
     Il peut être enrichi de peptone pour devenir un milieu très complet (MYPA).

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   Milieu "GYEA" (Glucose Yeast Extract Agar)

   Un milieu simple mais nutritif, composé de glucose, extrait de levure, et agar.
   Avantages :

   • croissance rapide,

   • formulation facile à adapter,
     mais moins utilisé en culture de routine que MEA ou PDA.

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   Milieu "Corn Meal Agar" (CMA)

   Moins riche, souvent utilisé pour observer la morphologie des structures reproductives (comme les spores ou les hyphes spécialisés).
   Peu utilisé en production, mais utile en laboratoire ou en identification taxonomique.

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Recette de préparation de la gélose MEA ou Sabouraud

La préparation d'une gélose est une étape essentielle pour la culture de champignons en boîtes de Pétri. Voici comment réaliser facilement un milieu de culture MEA ou Sabouraud :

Ingrédients nécessaires :

• 47 g de poudre de milieu MEA ou Sabouraud.
• 1 litre d'eau chaude (de préférence distillée ou déminéralisée).

Étapes de préparation :

1. Mélange : Délayez 47 g de poudre de milieu dans 1 litre d'eau chaude. Mélangez bien pour vous assurer que la poudre est complètement dissoute.

2. Stérilisation : Stérilisez le mélange à 121°C (15 PSI) pendant 20 à 30 minutes. Cela peut être fait à l'aide d'un autoclave ou d'une cocotte-minute. Cette étape est cruciale pour éliminer tout micro-organisme indésirable.

3. Refroidissement : Laissez refroidir le mélange jusqu'à environ 45-50°C. Ce refroidissement est important pour éviter la formation de condensation sur les couvercles des boîtes de Pétri.

4. Coulage : Dans un environnement stérile (sous une hotte à flux laminaire ou près d'un bec Bunsen), versez la gélose dans les boîtes de Pétri. Assurez-vous que l'épaisseur de la gélose est d'environ 0,5 à 1 cm.

5. Fermeture : Fermez rapidement les boîtes de Pétri pour éviter toute contamination par l'air ambiant.

Techniques de Stérilité en Mycologie

La stérilité est l’un des facteurs les plus cruciaux dans la culture de champignons, car les contaminants, comme les bactéries et les moisissures, peuvent rapidement envahir vos cultures et ruiner votre travail. En mycologie, la mise en place d'un environnement stérile tout au long du processus de culture est donc essentielle pour obtenir des résultats fiables. Voici quelques techniques de stérilité incontournables pour minimiser les risques de contamination.

1. Utilisation d'une hotte à flux laminaire

Une hotte à flux laminaire est un équipement conçu pour offrir un environnement stérile en filtrant l’air et en le poussant dans une direction uniforme. Cela permet de limiter la circulation d’air contaminé sur les surfaces de travail. Si vous ne disposez pas de hotte, vous pouvez travailler près d'une flamme de bec Bunsen, qui crée une barrière d'air stérile.

2. Porter des gants et un masque

Avant toute manipulation, il est recommandé de porter des gants stériles et un masque facial. Désinfectez vos gants avec de l'alcool isopropylique à 70 % avant de commencer chaque manipulation. Cela réduit la possibilité de transférer des contaminants des mains aux cultures.

3. Stérilisation des outils

Tous les outils utilisés, tels que les scalpels, les pinces ou les aiguilles, doivent être stérilisés. L’utilisation d'un bec Bunsen pour stériliser ces instruments par la chaleur est une méthode courante. Il est également possible de les stériliser avec de l'alcool isopropylique à 70 % suivi d’une flamme pour brûler les résidus d’alcool.

4. Stérilisation des milieux de culture

Les milieux de culture (gélose, liquides) doivent être stérilisés avant utilisation. La méthode la plus courante consiste à les passer à l'autoclave ou à la cocotte-minute à 121°C pendant 20 à 30 minutes pour éliminer tous les micro-organismes indésirables.

5. Désinfection de la surface de travail

La surface de travail doit être soigneusement nettoyée et désinfectée avant et après chaque session de travail. Un spray d’alcool à 70 % ou une solution d'eau de Javel diluée peut être utilisé pour désinfecter les surfaces, les boîtes et autres matériels à manipuler.

6. Ouverture minimale des boîtes de Pétri

Lorsque vous travaillez avec des boîtes de Pétri, il est important de les ouvrir le moins possible et de maintenir leur ouverture orientée face au flux d’air stérile ou au bec Bunsen pour éviter la contamination par l’air ambiant.

Exemple Typique : Prélever un Carpophore de la Nature pour une Culture

Voici un exemple détaillant les étapes à suivre pour prélever un carpophore (partie visible du champignon) de la nature, le cultiver sur une gélose Sabouraud + chloramphénicol pour le clonage, puis le multiplier sur une gélose MEA et enfin effectuer une culture liquide.

Étape 1 : Préparation des Milieux de Culture

• Préparez une gélose Sabouraud + chloramphénicol selon les instructions décrites dans l'article précédent.
• Préparez également une gélose MEA qui sera utilisée ultérieurement pour la multiplication du mycélium.

Étape 2 : Prélèvement du Carpophore

• Trouvez un carpophore sain dans la nature.
• Dans un environnement stérile, nettoyez la surface du carpophore avec un coton imbibé d’alcool isopropylique pour éliminer la majorité contaminants externes. Déchirez le champignon en évitant de toucher les parties internes du champignon.
• À l’aide d’un scalpel stérilisé, découpez un petit morceau du tissu interne du champignon. Travaillez rapidement pour minimiser l’exposition à l’air.

Étape 3 : Inoculation sur Gélose Sabouraud + Chloramphénicol

• Dans une boîte de Pétri contenant de la gélose Sabouraud enrichie en chloramphénicol (pour limiter la croissance bactérienne), placez le morceau de tissu prélevé.
• Refermez rapidement la boîte de Pétri et placez-la dans un incubateur à une température adéquate (généralement autour de 25-27°C pour la plupart des espèces de champignons).
• Surveillez régulièrement la boîte pour observer la croissance du mycélium, qui devrait apparaître sous forme de filaments blancs.

Étape 4 : Multiplication sur Gélose MEA 

• Une fois le mycélium bien développé sur la gélose Sabouraud, transférez un morceau de ce mycélium sain à l’aide d’un scalpel stérile vers une nouvelle boîte de Pétri contenant de la gélose MEA.
• Ce transfert permet d’accélérer la croissance du mycélium dans un milieu plus nutritif.

Étape 5 : Préparation d’une Culture Liquide

• Lorsque le mycélium s’est bien propagé sur la gélose MEA, il est temps de passer à une culture liquide pour une production plus importante de biomasse.
• Préparez un milieu de culture liquide stérile, comme du bouillon de malt, en le stérilisant à l’autoclave.
• Dans un bioréacteur ou un flacon stérile, inoculez ce milieu avec un morceau de mycélium prélevé de la gélose MEA.
• Placez le flacon dans un environnement sec et sombre à une température adéquate et secouez-le régulièrement pour assurer une bonne aération du milieu.