Comment réaliser des boîtes de Pétri pour la culture mycologique : Gui

La culture de champignons et la mycologie, l'étude des champignons, sont des domaines fascinants qui attirent de plus en plus d'adeptes, amateurs comme professionnels.

Pour ceux qui souhaitent s'initier à la culture de champignons en laboratoire ou à domicile, l'utilisation de boîtes de Pétri est un point de départ incontournable.

Ce guide pratique vous explique pourquoi utiliser des boîtes de Pétri, comment choisir le bon milieu de culture, et vous présente une méthode simple pour préparer et couler des géloses en vue de vos expériences de mycologie.

Pourquoi utiliser des boîtes de Pétri en mycologie ?

Les boîtes de Pétri sont des récipients plats et transparents, généralement en plastique ou en verre, utilisés principalement pour cultiver des micro-organismes sur une gélose nutritive.

En mycologie, elles permettent de créer un environnement contrôlé pour observer et étudier la croissance des champignons, que ce soit pour la recherche, la clonage, la sélection de souches ou simplement l'apprentissage. Les boîtes de Pétri offrent plusieurs avantages :

1. Contrôle des conditions de culture : Elles permettent de manipuler les paramètres tels que le type de milieu, la température, l'humidité, et l'exposition à la lumière.
2. Observation aisée : Le couvercle transparent facilite l’observation directe du développement des mycéliums sans ouvrir la boîte, minimisant ainsi les risques de contamination.
3. Facilité d’isolement et de sélection : Les boîtes de Pétri permettent d’isoler des souches spécifiques ou de sélectionner des mycéliums sains pour de futures cultures.

Les différents milieux de culture pour les boîtes de Pétri et leur utilité

Le choix du milieu de culture est crucial en mycologie, car il affecte directement la croissance et la santé des champignons. Les milieux de culture se présentent sous forme de poudres à mélanger avec de l'eau et sont enrichis de divers nutriments pour favoriser la croissance des champignons. Voici les principaux types de milieux de culture et leurs utilisations :

1. Milieu "MPA" (Malt, Peptone, Agar-agar) : Ce milieu est un classique de la mycologie. Il est idéal pour la multiplication de la plupart des mycéliums. En raison de sa composition équilibrée, il favorise une croissance rapide et saine des champignons, ce qui en fait un excellent choix pour les débutants.

2. Milieu "Sabouraud + Antibiotique" : Ce milieu est enrichi en antibiotique (chloramphénicol) pour limiter le développement des bactéries et rendre la culture très sélective. Il est recommandé pour des travaux plus délicats, tels que le clonage de champignons issus de la nature ou la germination de spores. Toutefois, la croissance des mycéliums sur ce milieu est généralement plus lente qu'avec le MPA.

3. Agar-agar pur : Si vous souhaitez expérimenter ou créer vos propres recettes de milieux, l’agar-agar pur est disponible séparément. Il est possible de l'enrichir avec différents ingrédients tels que l'extrait de pomme de terre, de malt, des croquettes pour chiens, de l'extrait de fumier, du sucre, de la sciure de bois, etc., en fonction des besoins spécifiques des champignons que vous cultivez.

4. Milieu "Water Agar" : Ce milieu est un agar sans enrichissement, principalement utilisé pour des travaux de laboratoire spécifiques tels que la purification de souches ou la sélection.

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Recette de préparation de la gélose MPA ou Sabouraud

La préparation d'une gélose est une étape essentielle pour la culture de champignons en boîtes de Pétri. Voici comment réaliser facilement un milieu de culture MPA ou Sabouraud :

Ingrédients nécessaires :

• 47 g de poudre de milieu MPA ou Sabouraud.
• 1 litre d'eau chaude (de préférence distillée ou déminéralisée).

Étapes de préparation :

1. Mélange : Délayez 47 g de poudre de milieu dans 1 litre d'eau chaude. Mélangez bien pour vous assurer que la poudre est complètement dissoute.

2. Stérilisation : Stérilisez le mélange à 121°C (15 PSI) pendant 20 à 30 minutes. Cela peut être fait à l'aide d'un autoclave ou d'une cocotte-minute. Cette étape est cruciale pour éliminer tout micro-organisme indésirable.

3. Refroidissement : Laissez refroidir le mélange jusqu'à environ 45-50°C. Ce refroidissement est important pour éviter la formation de condensation sur les couvercles des boîtes de Pétri.

4. Coulage : Dans un environnement stérile (sous une hotte à flux laminaire ou près d'un bec Bunsen), versez la gélose dans les boîtes de Pétri. Assurez-vous que l'épaisseur de la gélose est d'environ 0,5 à 1 cm.

5. Fermeture : Fermez rapidement les boîtes de Pétri pour éviter toute contamination par l'air ambiant.

Techniques de Stérilité en Mycologie

La stérilité est l’un des facteurs les plus cruciaux dans la culture de champignons, car les contaminants, comme les bactéries et les moisissures, peuvent rapidement envahir vos cultures et ruiner votre travail. En mycologie, la mise en place d'un environnement stérile tout au long du processus de culture est donc essentielle pour obtenir des résultats fiables. Voici quelques techniques de stérilité incontournables pour minimiser les risques de contamination.

1. Utilisation d'une hotte à flux laminaire

Une hotte à flux laminaire est un équipement conçu pour offrir un environnement stérile en filtrant l’air et en le poussant dans une direction uniforme. Cela permet de limiter la circulation d’air contaminé sur les surfaces de travail. Si vous ne disposez pas de hotte, vous pouvez travailler près d'une flamme de bec Bunsen, qui crée une barrière d'air stérile.

2. Porter des gants et un masque

Avant toute manipulation, il est recommandé de porter des gants stériles et un masque facial. Désinfectez vos gants avec de l'alcool isopropylique à 70 % avant de commencer chaque manipulation. Cela réduit la possibilité de transférer des contaminants des mains aux cultures.

3. Stérilisation des outils

Tous les outils utilisés, tels que les scalpels, les pinces ou les aiguilles, doivent être stérilisés. L’utilisation d'un bec Bunsen pour stériliser ces instruments par la chaleur est une méthode courante. Il est également possible de les stériliser avec de l'alcool isopropylique à 70 % suivi d’une flamme pour brûler les résidus d’alcool.

4. Stérilisation des milieux de culture

Les milieux de culture (gélose, liquides) doivent être stérilisés avant utilisation. La méthode la plus courante consiste à les passer à l'autoclave ou à la cocotte-minute à 121°C pendant 20 à 30 minutes pour éliminer tous les micro-organismes indésirables.

5. Désinfection de la surface de travail

La surface de travail doit être soigneusement nettoyée et désinfectée avant et après chaque session de travail. Un spray d’alcool à 70 % ou une solution d'eau de Javel diluée peut être utilisé pour désinfecter les surfaces, les boîtes et autres matériels à manipuler.

6. Ouverture minimale des boîtes de Pétri

Lorsque vous travaillez avec des boîtes de Pétri, il est important de les ouvrir le moins possible et de maintenir leur ouverture orientée face au flux d’air stérile ou au bec Bunsen pour éviter la contamination par l’air ambiant.

Exemple Typique : Prélever un Carpophore de la Nature pour une Culture

Voici un exemple détaillant les étapes à suivre pour prélever un carpophore (partie visible du champignon) de la nature, le cultiver sur une gélose Sabouraud + chloramphénicol pour le clonage, puis le multiplier sur une gélose MPA et enfin effectuer une culture liquide.

Étape 1 : Préparation des Milieux de Culture

• Préparez une gélose Sabouraud + chloramphénicol selon les instructions décrites dans l'article précédent.
• Préparez également une gélose MPA qui sera utilisée ultérieurement pour la multiplication du mycélium.

Étape 2 : Prélèvement du Carpophore

• Trouvez un carpophore sain dans la nature.
• Dans un environnement stérile, nettoyez la surface du carpophore avec un coton imbibé d’alcool isopropylique pour éliminer la majorité contaminants externes. Déchirez le champignon en évitant de toucher les parties internes du champignon.
• À l’aide d’un scalpel stérilisé, découpez un petit morceau du tissu interne du champignon. Travaillez rapidement pour minimiser l’exposition à l’air.

Étape 3 : Inoculation sur Gélose Sabouraud + Chloramphénicol

• Dans une boîte de Pétri contenant de la gélose Sabouraud enrichie en chloramphénicol (pour limiter la croissance bactérienne), placez le morceau de tissu prélevé.
• Refermez rapidement la boîte de Pétri et placez-la dans un incubateur à une température adéquate (généralement autour de 25-27°C pour la plupart des espèces de champignons).
• Surveillez régulièrement la boîte pour observer la croissance du mycélium, qui devrait apparaître sous forme de filaments blancs.

Étape 4 : Multiplication sur Gélose MPA

• Une fois le mycélium bien développé sur la gélose Sabouraud, transférez un morceau de ce mycélium sain à l’aide d’un scalpel stérile vers une nouvelle boîte de Pétri contenant de la gélose MPA.
• Ce transfert permet d’accélérer la croissance du mycélium dans un milieu plus nutritif.

Étape 5 : Préparation d’une Culture Liquide

• Lorsque le mycélium s’est bien propagé sur la gélose MPA, il est temps de passer à une culture liquide pour une production plus importante de biomasse.
• Préparez un milieu de culture liquide stérile, comme du bouillon de malt, en le stérilisant à l’autoclave.
• Dans un bioréacteur ou un flacon stérile, inoculez ce milieu avec un morceau de mycélium prélevé de la gélose MPA.
• Placez le flacon dans un environnement sec et sombre à une température adéquate et secouez-le régulièrement pour assurer une bonne aération du milieu.

Conclusion

La réalisation de boîtes de Pétri avec les milieux de culture appropriés est une compétence de base mais essentielle pour tout débutant en mycologie. Avec les bons outils et produits, tels que ceux disponibles sur notre site lamycosphere.com, vous pouvez facilement vous lancer dans l'étude fascinante des champignons.

N'oubliez pas que le succès en mycologie dépend largement du respect des procédures de stérilisation et du choix du milieu de culture adapté à votre projet. Bonnes cultures !